Prøver av vev av mumier under navnene "Maria" og "Vavita" ble sendt fra Peru til et russisk laboratorium for forskning. De tilveiebragte prøvene av biologisk vev ble studert ved bruk av skanningselektronmikroskopi, Raman-spektre, ICPE, og sammensetningen av kiselgur (et stoff på overflaten av huden til mumier) ble undersøkt. En undersøkelse av DNA fra overførte vev ble også utført.
Prøveforberedelse
Vevsprøver på 500 ug ble overført til plastrør og oppløst i 1 ml buffer (10 mM Tris-HCl pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Til de resulterende suspensjoner ble Na-dodecylsulfat tilsatt til 0,5%, oppvarmet til +80 ° C, og etter 10 minutter ble proteinase K (opptil 500 ug / ml) plassert i en termostat (+55 ° C) i 24 timer.
Deproteinisering ble utført ved fenolmetoden: tilsetning av fenol i like volum til suspensjonen, deretter fenol: kloroform (1: 1), kloroform; etter hver tilsetning ble konstant omrøring utført på en vinkelrotor og sentrifugering ved 15 000 o / min, 10 minutter.
Til supersedimentet oppnådd etter den tredje sentrifugeringen ble det tilsatt 1/10 del av volumet av 1 M NaCl og 2,5 volum to ganger destillert etylalkohol, og fikk stå natten over ved -30 ° C i koniske prøverør - "Eppendorf". Sentrifugering ble utført ved 15 tusen vol. min. innen 10 minutter og mottatt DNA "utfelt" i form av et brunt bunnfall. DNA-pelleten ble vasket to ganger med 70% etylalkohol og tørket ved romtemperatur (1 time) og deretter oppløst i TE-buffer.
PCR ble utført på en programmerbar termisk syklator "My Cycler" ("Bio = Rad") ved bruk av standard oligoprimere syntetisert ved fastfasemetoden ved foreningen "Beagler" (St. Petersburg). Reaksjonsblandingen for amplifisering med et volum på 25 μL inkluderte: 15 nM av hver oligoprimer, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 ved +25 ° C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanol, 170 μg / ml BSA og en blanding av fire basiske dNTP-er i en konsentrasjon på 1,0 mM hver og termostabil DNA-polymerase Thermus thermophilis (5 U / mL) (NPO SibEnzim). Etter denaturering (10 minutter, 94 ° C) ble 35 amplifiseringssykluser utført for hvert testsystem: 94 ° C - 1 min., 58 ° C - 1 min., 72 ° C - 1 min. For å kontrollere spesifisiteten ble DNA-prøver med kjente genotyper for de studerte loci (markørsystemer) så vel som kontrollprøver introdusert i reaksjonen.som inneholder en blanding av reagenser uten DNA. Etter amplifisering ble en fargingsbuffer tilsatt til alikvoter av reaksjonsblandingen (7 ul) og separert ved vertikal elektroforese i 6% polyakrylamidgel (210x150x1 mm), farget med etidiumbromid og fotografert under ultrafiolett lys. For å identifisere alleler ble alleliske standarder som tilsvarte disse lokiene ("stiger") brukt.
Salgsfremmende video:
DNA-analyse
For studien brukte vi metoden for eksomanalyse av humant DNA basert på sekvensering med høy gjennomstrømning med berikelse ved hybridisering.
Teknikk for eksomanalyse av humant DNA.
2 prøver ble analysert … Alle stadier av prøveforberedelse før PCR ble utført i rene rom. Prøveforberedelse, DNA-ekstraksjon og amplifisering av individuelle DNA-fragmenter ble utført i forskjellige rom.
Spesifikke adaptere (KAPA Library Preparation Kit og SeqCap Adapter Kit; Roche) ble ligert til endene av det genomiske fragmenterte DNA (~ 5 ng), hvoretter et to-trinns utvalg av fragmenter i 200-350 bp lengdeområdet ble utført ved bruk av AMPureXP Beads (Beckman Coulter) … De resulterende fragmentene ble amplifisert med adapter-spesifikke primere og hybridisert med biotinylerte spesifikke prober (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) i 28 timer ved 47 ° C. I en reaksjon ble to DNA-prøver kombinert. Biotinylerte sonde-DNA-hybrider ble isolert og renset med streptovidinkonjugerte magnetiske partikler, en andre amplifisering og kvalitativ vurdering av det resulterende DNA-biblioteket ble utført (TapeStation 4200; Agilent Technologies). For å fjerne amplifikasjonsfragmenter utenfor mål og adapterdimerer ble DNA-biblioteket renset på nytt ved bruk av AMPureXP Beads magnetiske partikler (fig. 1). Den endelige konsentrasjonen av det forberedte bibliotek ble evaluert på et Quantus-instrument ved bruk av et kommersielt QuantiFluor® dsDNA-systemsett (Promega). Det resulterende DNA-biblioteket ble immobilisert på overflaten av strømningscellen. Sekvensering ble utført på Illumina-plattformen ved bruk av en standard flytcelle og MiSeq-reagenssett v2 300 (2 x 150 sykluser). Det resulterende DNA-biblioteket ble immobilisert på overflaten av strømningscellen. Sekvensering ble utført på Illumina-plattformen ved bruk av en standard flytcelle og MiSeq-reagenssett v2 300 (2 x 150 sykluser). Det resulterende DNA-biblioteket ble immobilisert på overflaten av strømningscellen. Sekvensering ble utført på Illumina-plattformen ved bruk av en standard flytcelle og MiSeq-reagenssett v2 300 (2 x 150 sykluser).
Figur: 1
Generell vurdering av kvaliteten på sekvensert DNA
Standardmetoder som FastQC og Jellyfish og KraTER-programmene ble brukt for den første kvalitetsvurderingen. Kvalitetsvurderingen viste ingen kvalitetsproblemer med den sekvenserte DNA-avlesningen for begge prøvene. Bilder vises ikke fordi de ikke er informative.
For den første prøven (videre M, stor mumie "Maria") ble 113,4 M avlesninger sekvensert, for den andre prøven (videre W, liten mumie "WaWita") ble 22,9 M avlesninger sekvensert.
Neste trinn var å rense de sekvenserte lesene fra forskjellige tekniske sekvenser som ville forstyrre den videre analysen. Til dette ble Cookiecutter-programmet brukt. Etter rengjøring var det henholdsvis 113,3 M (99%) avlesninger og 22,8 M (99%) avlesninger for M og W.
Beregning av mengden gammelt DNA og dets separasjon fra moderne
Standardmetoden for å vurdere nærvær og mengde antikk DNA er å estimere mengden tidsskadede nukleotider. For dette ble MapDamage 2.0-programmet brukt. MapDamage 2.0 som viste mengden gammelt DNA i 30,1%, men siden MapDamage innebærer at vi bruker en nær referanse, og vi ikke vet nøyaktig hvor nær begge prøvene er genomet til moderne mennesker, og vi brukte et exome-bibliotek, var denne metoden i seg selv ikke tilstrekkelig. En annen god metode for å vurdere gammelt DNA er antall korte fragmenter.
Filtrering av det påståtte gamle DNA skjedde i tre stadier. På det første trinnet ble alle sammenkoblede leser som ikke kan krysses og samlet i en uparret lesning med en overlapping fjernet. Disse lesene indikerte at det opprinnelige fragmentet som ble sekvensert var lengre enn 300 bp. og mest sannsynlig moderne DNA. Så etter dette trinnet var det henholdsvis 86,9% og 91,8%. Etter det ble enkelt overlappede fragmenter valgt slik at lengden deres var kortere enn 150 bp, siden dette er lengden vi forventet for eldgamalt DNA. Etter dette trinnet forble henholdsvis 8,6% og 38,5% for prøvene M og W. Det skal bemerkes at til tross for forskjellen i prosent, er det absolutte antall lesninger mellom prøvene M og W veldig likt: 9,8M og 8,8M, noe som kan forklares med det faktum at innholdet av eldgamalt DNA i begge prøvene er likt.
| Parameter | Eksempel M (Maria) | Eksempel W (Wawita) |
| Antall avlesninger | 113.3M | 22.8M |
| Prosentandel av korte fragmenter <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Prosentandel av korte fragmenter <150 bp (antall) |
8,6% (9 846 035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Andel fragmenter justert per menneskelig genom (antall) |
2,03% (2,345,084) |
9,65% (2 264 551) |
| Prosentdel av fragmenter justert per humant genom fra kort <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Innhenting av DNA som ligner på referansen humant genom
Det resulterende antatte antikke DNA ble kartlagt til et referanse-humant genom ved bruk av en standard genomisk variant-søkelinje ved bruk av BWA, samtools og Wcftools.
Videre ble bare 23,8% av prøven M og 25,6% vellykket kartlagt til referansegenomet til moderne mennesker. For begge prøvene kunne 75% av de sekvenserte lesene ikke kartlegges på det humane genomet. Dette kan forklares både ved forurensning og ved at disse prøvene befinner seg langt nok fra genomet til moderne mennesker. Samtidig er det verdt å huske på at vi har sekvensert eksombiblioteket og derved minimert forurensningen av bakteriell DNA.
Innledende rekognoseringsanalyse av ukokt lesning viste at noen av dem tilhørte repeterende DNA spesifikt for hovdyr, dette kan forklares med det faktum at lama-fett ble brukt til mumifisering.
En mer detaljert analyse krever omtrent tre ukers beregning, siden de eksisterende løsningene bare er laget for virale og bakterielle genomer, og vi må sammenligne med alle eksisterende genom, inkludert plantegenom, for å forstå hvilke arter som ble sekvensert.
Kjennetegn på de valgte alternativene
De kartlagte avlesningene ble brukt til å søke etter varianter som skiller M- og W-prøver fra det moderne menneskelige genom, samt for å vurdere forurensning av avlesninger fra det menneskelige Y-kromosomet.
Det første spørsmålet som måtte besvares, var hvilke kromosomer de sekvenserte lesene ble kartlagt til.
Siden vi vet at Marias prøver ble isolert fra bein og muskler, og Vavita bare fra bein, forventet vi en forskjell i mengden mtDNA. Men det var ikke mye av forskjellen.
Antall kartlagte avlesninger på Y er en annen test for forurensning av moderne mennesker. Interessant nok viste det seg å være det samme i begge prøvene.
Statistikken for variantene som er funnet vises nedenfor:
| parametere | Eksempel M (Maria) | Eksempel W (Wawita) |
| Antall funnet alternativer | 79957 | 48941 |
| Antall alternativer på Y | 534 | 541 |
| Antall pålitelige alternativer (mer enn 20 leser og mer enn 30 kvalitet) | 16969 | 6181 |
| Varianter med kjent rsid (tilgjengelig i snip-databasen) | 5701 | 3089 |
| Generelt gyldige alternativer | 92 | |
| vanlige alternativer med rsid | 49 |
Etter det ble det mulig å svare på spørsmålet: er M og W pårørende? Svaret er nei.
Bare 49 matchende varianter ble funnet mellom M og W og 3040 forskjellig for varianter med kjent rsid. Dessuten er dette kanskje forskjellige typer eller underarter av en person eller en ukjent skapning.
Interessant nok er variantene med Y-kromosomet identiske for begge prøvene, noe som indikerer forurensning av samme person, og at det i antikkens DNA fra Y-kromosomet sannsynligvis fortsatt ikke er noe kromosom.
Evaluering av likheten med de eksisterende sekvenserte menneskelige genomer fra 1000 Human Genome Project
Merk at dette kun er en omtrentlig analyse, siden for en mer nøyaktig analyse er det behov for varianter fra regioner i genomet under nøytralt utvalg, og vi har eksomdata.
Ikke desto mindre, ved bruk av 5708 varianter for M eller 3096 for S, var det mulig å utføre en variant av analysen sammenlignet med dataene fra 1000 humane genomer.
Resultatet av PCA-analysen på bildet nedenfor er et overlegg med to bilder for M og W, beregnet hver for seg, siden det er for få vanlige alternativer mellom M og W til å estimere avstandene mellom M og W.
Likhetsscore.
Som du ser er det ikke tilfeldigheter med noen gruppe gener, de skiller seg også fra hverandre. Men det må huskes at vi brukte kodesekvenser under seleksjon, og det anbefales å bruke varianter under nøytralt utvalg.
Likevel er PCA-resultatet godt samstemt med manuell verifisering av varianter, som viste at dataene er i en ikke-referert homozygote, noe som igjen indikerer at bildene er langt fra det moderne menneskelige genom.
Konklusjon
Dessverre var vi begrenset til bare to prøver, vanligvis i denne typen analyser brukes mer, minst 3-10 i det minste på en eller annen måte relatert. Derfor er det nødvendig å fortsette forskningen med et stort antall prøver.
Samtidig kan vi mest sannsynlig konkludere med at DNA-prøvene til Mary og Vavita tilsvarer humant DNA, men ikke sammenfaller med det DNA som er tilgjengelig fra databasen på 1000 mennesker.
Forfattere av rapporten: Baranov V. S. og Aseev M. V. (Scientific Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Department of Prenatal Diagnostics), Glotov A. S. og Glotov O. S. (St. Petersburg State University), A. S. Komissarov (Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences, Center for Genetic Bioinformatics).
Materialer levert av Konstantin Georgievich Korotkov (doktor i tekniske vitenskaper, professor, University of Information Technologies, Mechanics and Optics) og Dmitry Vladislavovich Galetsky (kandidat for medisinsk vitenskap, I. P. Pavlov første St. Petersburg State Medical University).
For mer om Nazca mumier, se taggen: Nazca mumier.
