Oppfinnelsen av CRISPR-Cas genredaktøren kalles en revolusjon innen biologi. Forskere lover å bruke den til å forbedre plantesorter og dyre raser for landbruk, for å behandle medfødte genetiske sykdommer hos mennesker. RIA Novosti-korrespondenten gikk for å se hvem og hvordan genomet som redigeres.
Genome Editing Center ved Moskva statsuniversitet åpnet for litt over et år siden - på campus. Jeg blir møtt av direktøren, doktor i kjemi Peter Sergiev, og mens vi sykler i heisen, bruker han litt på historien om genteknologi.
”Genomet har blitt redigert før. Men det var vanskelig å lage verktøy for dette, det tok lang tid, og resultatet var ofte ikke slik vi ønsket det, sier han.
I vivarium bytter Pyotr Vladimirovich til blå laboratorieklær, de gir meg en hvit overall i engangsbruk og ber meg tørke av kameraet med alkohol. Nå ser Petr Vladimirovich ut som en kirurg, og jeg - som en laboratorieassistent fra serien "CSI - Crime Scene".
I det sterile laboratoriet er det klargjort en beholder med befruktede musegg og et prøverør med RNA-løsning. Det er alt du trenger for CRISPR-Cas genomredigering.
CRISPR er et engelsk forkortelse for en frase som bokstavelig talt betyr "regelmessige grupperte korte palindromiske repetisjoner." Faktisk er dette bare små deler av DNA-et fra bakteriofagvirus som er innebygd i bakteriegenomet. Disse sekvensene er nødvendige for at det bakterielle immunforsvaret skal fungere og tjene som en slags "politiets ønsket" kunngjøring. Hvis bakterien overlever etter å ha blitt smittet med en bakteriofag, bruker den Cas-protein-enzymer for å kutte et stykke av sitt DNA og sette det inn i sitt genom for å bli gjenkjent senere. Bakteriegenomet arver dette biblioteket av "fiender" nøye samlet av tidligere generasjoner.
I 2013 fant forskere ut at Cas-proteinet fungerer i enhver organisme, inkludert pattedyr. Han er i stand til å gjøre retningsbestemmelser i begge trådene av DNA-molekylet og dermed endre genomet.
Salgsfremmende video:
Eggmanipulering
Petr Sergiev lager et glass kapillær med en diameter på hundre mikron ved mikrosmeden, drar et egg i det og overfører det under glass med et næringsmedium. Den ferdige prøven blir sendt til scenen med det optiske mikroskopet. Monitoren viser et forstørret bilde av egget, dirrende i spissen av kapillæren. To avrundede flekker skiller seg ut - dette er pronukler med DNA til mor og far.
Forskeren forbereder en ny kapillær med en størrelsesorden mindre i diameter. Dette er en injeksjonssprøyte. Den samler en løsning med to typer RNA i den, og ved hjelp av manipulatorer stikker egget forsiktig. Det er det, injeksjonen er ferdig.
RNA injisert i egget er nødvendig for å kutte genomet på et gitt sted. En type RNA inneholder en strengt definert sekvens av nukleotider, lik den vi hadde tenkt å endre. Oppgaven til dette RNA er å finne den tilsvarende regionen i DNA, derfor kalles den "guide". RNA av den andre typen, matrise, er en slags instruksjon for syntesen av Cas9-nukleaseproteinet. Dette proteinet fungerer som katalysator for en kjemisk reaksjon som bryter fosfodiesterbindinger mellom veldefinerte DNA-baser. Siden proteinmolekylet har to nukleasesentre, åpnes begge DNA-strengene, for øvrig på stedet, koordinatene som Cas9 "regnet" med guide RNA.
DNA-molekylet oppfatter bruddet i begge trådene som et alvorlig sammenbrudd og søker å reparere det. Eksonukleasenzymer som flyter i cellen fjerner umiddelbart flere nukleotider fra begge ender av bruddet. Dette er nok til å bryte, eller som genetikere sier, "slå av" et gen.
Slik fungerer den genomiske redaktøren CRISPR-Cas9 / Illustrasjon av RIA Novosti. Alina Polyanina.
Hvis det er nødvendig med en rettet mutasjon, for eksempel, er det nødvendig å merke et protein for å spore det i kroppen, legges en annen mal til komplekset til to RNA i form av et spesialdesignet DNA. Den består av sekvenser som er identiske med kantene til det fremtidige bruddet, og inneholder også delen som skal settes inn. Etter at Cas9 har kuttet DNA-molekylet, kobles endene til ved hjelp av denne tilleggsmalen, så settet med nukleotider vi trenger settes inn i bruddet.
”Vi kan feste en liten hale til ekornet, som det er praktisk å trekke den ut og se hva den samhandler med. Vi kan sette inn et gen, men det er ikke så effektivt som å slå det av, fortsetter forskeren.
GMO og kimærer
Det redigerte egget vil bli transplantert i livmorrøret til en surrogatmus. Hun bodde en tid sammen med en hann som hadde seminiferøse tubuli bundet. Paret hadde et normalt sexliv, men kunne ikke bli gravid. Likevel trodde musens kropp at hun var gravid, og dannet passende hormonell bakgrunn for henne. Nå bærer denne hunnen andres foster.
Om tre uker vil hun føde de mest vanlige musene. Forskere vil vente til gnagerne vokser opp, tar en liten bit av halen fra dem og bruker PCR for å analysere DNA-bitet som de redigerte. En mutasjon eller et deaktivert gen finnes i mer enn halvparten av tilfellene. Den omvendte prosedyren - innsetting av en sekvens i genomet - lykkes ikke mer enn 10% av eksperimentene.
Ulike interessante effekter dukker opp når du redigerer. For eksempel fødes mosaikkmus, eller kimærer, som har celler med forskjellige varianter av moder- og fostergenomen. Cas9 kan kutte DNA mange ganger, men messenger-RNA som koder for det, er ikke evig, og den injiserte løsningen forsvinner ganske enkelt i en serie av celledelinger. Noen ganger fyrer redaktøren fremdeles igjen etter at pronuklene har smeltet sammen og egget har delt. Og siden DNA-reparasjon etter et brudd alltid er en tilfeldig prosess og helbredelse aldri skjer på samme måte, vil noen av cellene i en organisme inneholde en annen mutasjon.
For vitenskap og medisin
Vi beveger oss inn i det tilstøtende rommet for å se live-resultatene fra genomredigeringseksperimentene. I hyllene til venstre - containere med genmodifiserte mus, til høyre - med vanlige gnagere for kontroll. De ble dyrket, som de til venstre, men genomet ble ikke manipulert. Kontrollmus er nødvendig for å ha en norm foran øynene våre og sammenligne skapningene oppnådd i eksperimentet med den.
Pyotr Sergiev tar en av beholderne med et par grå mus. Utad er de helt vanlige, men de har ikke avkom. Fakta er at hos hannen er genet fra en av RNA-metyltransferaser, et enzym som bare produseres i sæd, slått av. Menn med inaktivt gen blir født sterile. Det nøyaktige formålet med genet og enzymet er fremdeles ukjent. For å finne ut av det ble det avlet to stammer av mus på laboratoriet: den ene hadde et gen slått av, det andre hadde et protein merket med en genomisk redaktør.
”En mutasjon i dette genet finnes også hos mennesker - da lider en mann av infertilitet. Men inntil vi finner ut hvorfor det er nødvendig, hvorfor det endrer RNA, vil vi ikke være i stand til å hjelpe slike pasienter,”forklarer forskeren.
Faktisk kjenner vi fremdeles ikke funksjonen til de fleste menneskelige gener. Å finne ut av dette er en grunnleggende oppgave løst av mange forskningsgrupper rundt om i verden, inkludert i Russland. Musens genom er veldig likt det hos mennesker. Man håper at med hjelp av CRISPR-Cas vil studiet av genomet til enhver skapning gå raskere.
Sergievs gruppe sammen med N. N. NN Petrova begynte å lete etter mutasjoner som fører til noen typer kreft. De nærmeste planene inkluderer et prosjekt for å lage genmodifiserte dyr for jordbruk i samarbeid med det allrussiske forskningsinstituttet for husdyrhold og Institute of Gene Biology fra Russian Academy of Sciences.
“CRISPR-Cas er et fantastisk verktøy som lar deg endre genomet etter eget skjønn, til å være litt av Gud. Til syvende og sist er vitenskapens oppgave å forstå hvordan en så kompleks skapning som et pattedyr fungerer, sier forskeren.
Å løse grunnleggende vitenskapelige problemer er stort, men hva vil denne teknologien gi medisin? I overskuelig fremtid, akk, ikke mye. Det er lett å redigere et egg og oppdra en genmodifisert mus, men det er umulig å korrigere genene til et voksent dyr, enn si et menneske.
Metoder for å redigere DNA i somatisk (det vil si allerede dannede celler) er fremdeles veldig ineffektive. For å introdusere et gen som er slått av ved mutasjon i en celle og tvinge det til å produsere et visst protein, må du fjerne noen av cellene fra kroppen, redigere DNAet i dem og legge det tilbake i kroppen. I prinsippet er det håp om at det på denne måten vil være mulig å bekjempe sykdommer som Duchenne muskeldystrofi eller cystisk fibrose, når det er nødvendig å gjenopprette effektiviteten til en del av cellene. Når det gjelder predisposisjonen for kreft, er den genomiske redaktøren så langt maktesløs. Hvis et mutant gen finnes i en person, så finnes det i alle celler i kroppen. Det er urealistisk å endre dem alle. Og hver celle med en mutasjon er en kilde til fare.
Men selv om CRISPR / Cas vil bidra til å svare på bare noen grunnleggende spørsmål og tillate behandling av sjeldne genetiske sykdommer, vil det fremdeles være et stort skritt fremover for menneskeheten.
Tatiana Pichugina
