Optogenetikk er en metode for å studere eksiterbare celler som bruker proteiner som er innebygd i cellemembranen og aktiveres av lys (derav "opto"). Slike proteiner (opsins) finnes i de fleste dyr i netthinnen i øynene, så vel som i noen planter, for eksempel i grønne alger. For å integrere fotoaktiverte proteiner i nevronmembraner, er det nødvendig å innføre rhodopsin-gener oppnådd fra andre organismer i nevroner, derav "genetikken". I 2015 feiret optogenetikk tiårsjubileum. I løpet av denne tiden har et effektivt verktøy for å studere nervesystemet blitt sterkere og har mottatt en rekke applikasjoner som opprinnelig ikke var tilgjengelige.
Hjernen og dens elementer
Bevissthet, personlighet, intelligens - alt dette er skapt av nevroner. Dette betyr at hvis vi ønsker å studere disse aspektene ved det menneskelige (og ikke bare) vesenet, må vi definitivt forstå hva som skjer med nervecellene til gjenstanden for studien. Hovedproblemet er at det er for mange av disse nervecellene, og det er umulig å følge med på alle nevroner på en gang. I tillegg har nerveceller en tendens til å danne klynger, så det er problematisk å skille virkningen av en nevron fra en annen, og å handle på hver celle separat i de fleste tilfeller. Det er to måter ut av dette: å akseptere og registrere aktiviteten til grupper av celler, få en slags "gjennomsnittstemperatur på sykehuset", eller fortsatt prøve å undersøke en nevron, hvis mulig - veldig nødvendig og viktig for kroppen. Den første brukes oftere i studier av pattedyrhjernen,den andre - på enkle nervesystemer (for eksempel overvåker de den elektriske aktiviteten til store "kommandonevroner" av den defensive oppførselen til en druesnegl eller celler i sjøen gastropod alysia som har lignende egenskaper). Bløtdyr, ormer og fruktfluer med sine relativt små nervesystemer er selvfølgelig gode, men de er veldig langt fra mennesker. Jeg vil gjerne utforske noen som har hjernen nærmere strukturen vår, og derfor oftere velge den første tilnærmingen.hvis hjerne er nærmere vår i struktur, og derfor blir den første tilnærmingen oftere valgt.hvis hjerne er nærmere vår i struktur, og derfor blir den første tilnærmingen oftere valgt.
Det er mange metoder for å studere nervesystemet, men de er nesten ikke veldig nøyaktige. Det er funksjonell magnetisk resonansavbildning, som ikke tillater å se enkeltceller og bare gjenkjenner relativt langsomme prosesser (endringer i blodtilførselen til cerebrale kar). Det er elektroencefalografi, det er raskere, men det skiller heller ikke mellom individuelle nevroner og ligner på å prøve å registrere noe leselig ved å henge en mikrofon over en fotballbane midt i en kamp. Til slutt kan fluorescerende fargestoffer brukes som endrer farge som respons på endringer i konsentrasjonen av visse ioner i cellen eller til deres totale ladning (det vil si til neuronets membranpotensial). Disse fargestoffene virker ganske sakte. Deres tidsmessige oppløsning (responstid) er ikke høy nok til å oppdage og "vise" et eget handlingspotensial i en nevron. Mer presist,dette ble vurdert inntil en nylig publikasjon, hvis forfattere fortsatt var i stand til å gjøre dette (Science, 2015, 350, 6266: 1361–1366, doi: 10.1126 / science.aab0810).
Med andre ord er det ikke så lett å registrere aktiviteten til en enkelt celle uten å påvirke nabonevronene. Det er enda vanskeligere å spesifikt endre denne aktiviteten. Du kan injisere farmakologiske medikamenter i hjernen som bare virker på celler med visse egenskaper, og deretter se på disse cellene under et mikroskop eller lage en del av et dyrs hjerne og registrere dens elektriske aktivitet med mikroelektroder. Men for å få et slikt stoff, må dyret avlives. Selv om vi legger medlidenhet med dyr og hensyn til menneskeheten, må det innrømmes at slike eksperimenter er ekstremt sløsing. For å finne ut hvordan signalene til et lite antall celler har endret seg, må du dyrke en hel hjerne, mate den og ta vare på den, og etter å ha forberedt den, kan den brukes i halvannen time, sjelden lenger.
Et annet alternativ er å stimulere individuelle nevroner med elektriske signaler av kunstig opprinnelse, føre disse signalene langs den tilsvarende nerven, eller vanne celler med nevrotransmittere i rammen av en kunstig synapsmodell. Men for dette må du først finne passende celler, og dette er ikke en triviell oppgave.
Endelig er det en metode for kunstig frigjøring av glutamat fra synaptiske vesikler under påvirkning av ultrafiolett stråling (denne metoden kalles også glutamat uncaging). Faktisk etterligner lyset i dette tilfellet handlingen til et eksitasjonssignal som ankommer cellen, og utløser frigjøring av en nevrotransmitter ved synapsen. Dette er et veldig nøyaktig og effektivt verktøy, men det har også en ulempe. Ved å utføre ultrafiolett lys er de nå i stand til å frigjøre bare glutamat, men ikke alle nevroner skiller det ut, og ikke noen annen signalbærer. I tillegg aktiverer ikke den kunstige frigjøringen av glutamat målneuronet like sterkt som elektrisk stimulering langs nerven, og det er problematisk å gjøre celleutgangspotensialene i dette tilfellet.
Salgsfremmende video:
Fra alger til nevron
Siden 2005 har den subtile manipulasjonen av nevral aktivitet blitt mulig, og dette har blitt hjulpet av fotoaktiverte stoffer som kan fange lyskvanta og reagere på dem. Noen av dem har vært kjent lenge siden begynnelsen av 1970-tallet, men de lærte bare å bli anvendt i nevrobiologisk forskning på midten av 2000-tallet.
Den encellede algen Chlamydomonas reinhardtii har et protein som heter chanelrodopsin-2 (ChR2). Fra navnet er det tydelig at det er en slektning av rhodopsin av netthinnestenger. I likhet med ørepigmentet reagerer chanelrodopsin på lysbestråling, bare på en litt annen måte: det øker tilstrømningen av positive ioner inn i algecellen. Dette påvirker membranpotensialet (hvilepotensialet): i løpet av tusenvis av et sekund nærmer det seg null fra en bevisst negativ; eksperter sier: "cellen er depolarisert." I dette tilfellet genererer ikke Chlamydomonas-cellen handlingspotensialer, men dette ville teoretisk være mulig: elektriske signaler som ligner på handlingspotensialer kan også oppstå i planteceller (Plant, Cell and Environment, 2007, 30, 249–257, doi: 10.1111 / j. 1365-3040.2006.01614.x).
Da chanelrodopsin-2-genet ble isolert fra Chlamydomonas og klonet, ble dens nukleotidsekvens kjent for flere forskerteam, inkludert Karl Deisseroths laboratorium ved Stanford University. Denne hendelsen viste seg å være avgjørende for fødselen av optogenetikk. Mens andre grupper begynte å aktivt studere mangfoldet av kanaler, la sjefen for dette laboratoriet, en nevrofysiolog og også en psykiater (sannsynligvis den praktiske tankegangen til legen Deisseroth spilte en viktig rolle i valget av studieobjekt), noe som var verdig anvendt bruk i ChR2. Siden vi har et protein som er i stand til å endre membranpotensialet til en celle, og vi har genet, hvorfor ikke sette dette genet inn i en elektrisk eksiterbar celle og se hva som skjer?
Ikke tidligere sagt enn gjort. Genet for chanelrodopsin-2 ble festet til en promoter (en DNA-sekvens som indikerer for RNA-polymerase at den neste delen av molekylet skulle leses og lages fra dens mRNA-prøve), ble satt inn i viruset, og selve viruset ble injisert med en fin nål i musens hjerne. Vi trenger bare å sjekke hvor nøyaktig de virale partiklene kom, om vi savnet injeksjonsstedet. For å forstå dette, i tillegg til genet for det lysfølsomme proteinet, er det nødvendig å introdusere genet fra et reporterstoff i nevronen - dette stoffet vil indikere tilstedeværelsen av chanelrodopsin. En praktisk reporter er et fluorescerende protein, fordi fluorescens i celler er synlig både på skiver av hjernen, og - med tilstrekkelig konsentrasjon - selv utenfor kroppen. ChR2-genet og reportergenet (for eksempel det gule fluorescerende proteinet YFP) er under den samme promotoren, så de blir uttrykt sammen,og begge proteiner blir produsert i cellen på samme tid. Hvis det er chanelrodopsin i cellen, lysstoffrør.
Nesten alt er klart, alt som gjenstår er å bygge en lyskilde inn i hjernen, som vil aktivere cellene som bærer chanelrodopsin. Denne kilden er typisk en miniatyr fiberoptisk LED som produserer lys med en bølgelengde på omtrent 480 nm (blå). Det er til denne strålingen ChR2 reagerer mest effektivt. Fiberen blir injisert i det ønskede området av hjernen og fikset med en spesiell kanyle på overflaten av skallen (fig. 1). Et dyr kan bruke en slik enhet i veldig lang tid, og for å registrere aktiviteten til cellene trenger den ikke å bli drept. Og dette er bra både fra etisk synspunkt og fra praksis. Under et optogenetisk eksperiment kan den eksperimentelle skapningen bevege seg fritt, og dens oppførsel vil sikkert være nærmere naturlig enn om de samme nevronene blir studert i hjerneskiver eller i et dyr.fikset i stereotaksis under anestesi.
Figur: 1. Generelt opplegg for å introdusere en fotoaktivert kanal i nevroner.
Lyskilden alene er ikke nok til å gjennomføre et fullstendig eksperiment. Vi kan ikke fortelle hvordan de "eksperimentelle" nevronene reagerte på fotostimulering før vi bekrefter utseendet til elektriske signaler som respons på eksponering for lys. Derfor, parallelt med instrumentet for å aktivere nevronen, er det nødvendig med et middel for å registrere sin aktivitet, slik at mikroelektroder blir implantert i hjernen sammen med lyskilden. Med bruk av disse mikroelektrodene bekreftet Deisserot og kolleger i praksis at det med hjelp av chanelrodopsin er mulig å endre cellens membranpotensial kraftig og raskt, opp til generering av handlingspotensialer, og beskrev resultatene i artikkelen (Nature Neuroscience, 2005, 8, 1263-1268, doi: 10.1038 / nn1525). Tiden for optogenetikk begynte med dette arbeidet.
Brytere, brytere og andre
Channelrodopsin er ikke den eneste fotoaktiverte kanalen i tjenesten til optogenetikk. Det finnes også halorhodopsin (HR, fig. 2), et archaealprotein som, når det aktiveres av gult lys, slipper inn negativt ladede klorioner (og ikke positive natrium- og kaliumioner, som for cannelrodopsin). Dette fører til hyperpolarisering av cellemembranen: potensialforskjellen på den blir mer negativ enn i ro, og cellen, som tidligere lett ga ut handlingspotensialer, "blir lydløs" når halorhodopsin aktiveres.
Figur: 2. Arbeidsplan for halorhodopsin. Mens denne kanalen er aktiv, er det vanskeligere for cellen å generere handlingspotensialer.
Halorhodopsin og chanelrodopsin gener kan settes inn i samme celle, eller de kan introduseres i forskjellige. To fotoaktiverte kanaler med forskjellige egenskaper er bedre enn en. Men det er ikke alt (fig. 3). Det er også bakteriorhodopsin (BR) og protorhodopsin (PR). I likhet med channelrodopsin åpner de når de er aktivert for positivt ladede ioner, men ikke for alle, men bare for hydrogenioner - protoner. Og effekten er det motsatte av chanelrodopsin: protoner kommer ikke inn i cellen, men forlater den, på grunn av hvilken membranen hyperpolariserer og cellens evne til å begeistre går tapt.
Figur: 3. Variasjoner av fotoaktiverte kanaler brukt i optogenetikk.
Det er også eksotiske dyreopiner under det generelle navnet Opto-XR. Dette er ikke ionekanaler, men hybrider av rhodopsin i netthinnekeglene hos pattedyr og noen reseptorer kombinert med G-proteiner (G-proteiner bruker omdannelsen av nukleotid-BNP til GTP og utløser mange signalprosesser i celler). Spesielt bærer Opto-XR-serien fragmenter av adrenerge reseptorer, og en uvanlig art består av en del av rotte rhodopsin og en del av serotonin type 1A reseptoren. Uten å være kanaler kan Opto-XR selvfølgelig ikke gi et handlingspotensial, men aktiveringen av dem etterligner aktiveringen av reseptorer, deler de bærer i seg selv. Med andre ord, etter eksponering for Rh-CT (5-HT1A), vil cellen fungere som om serotonin var kommet til synapsen. Det er vist at slike hybridproteiner er lokalisert på nevronmembraner omtrent på samme sted,hvor er de virkelige reseptorene for lignende nevrotransmittere. Derfor kan de brukes til å studere forskjellige signaloverføringssystemer i hjernen, uten frykt for å oppnå resultater som er langt fra virkeligheten.
Nyere beskrev forskere ved University of Texas School of Medicine en hel familie av nye alghodopsiner som fører negativt ladede ioner i celler. De svarer på fotostimulering raskere enn rhodopsins som allerede er brukt i optogenetikk og krever mindre lys for aktivering (Science, 2015, 349, 6248, 647-650, doi: 10.1126 / science. Aaa7484). Kanskje har de en stor fremtid.
Optogenetikk og atferd
Men nok nevrofysiologisk teori, det er på tide å gå videre til praksis. Atferd avhenger av sekvensene av nevrale signaler som vises til rett tid på rett sted. Det viser seg at når vi kjenner til tid, sted og rekkefølge for disse signalene, kan vi gjenskape den ønskede formen for atferd og skaffe den manglende informasjonen om strukturer som denne atferden manifesterer seg gjennom.
En interessant studie om dette emnet ble nylig publisert i Nature (2015, 519, 233-236, doi: 10.1038 / nature14024). Selv om optogenetiske teknikker opprinnelig ble testet på gnagere, forbyr ingenting å gjøre det samme på andre modellobjekter, for eksempel på Drosophila. Selvfølgelig vil dette kreve å endre teknikken litt, fordi insekts nevrofysiologi er forskjellig fra nevrofysiologien til pattedyr.
Drosophila blir, som mennesker, påvirket av et langt opphold i nære klynger av sin egen art, med andre ord i en mengde. Med andre ord er de også gjenstand for gjeting. Det er kjent at karbondioksid for fruktfluer har en veldig ubehagelig lukt. En enslig flue, luktende CO2, flyr sakte dit luften er frisk. Hvis dette insektet var i en flokk, trekker andre seg raskt tilbake etter det. Selv om blant hundre fluer, bare halvparten kan lukte, og resten er blokkert av lukt, vil hele hundre bevege seg fra kilden til stanken. Denne synkroniteten oppnås merkelig nok ikke gjennom luktesansen. Unngåelsesreaksjonen i dette tilfellet er kollektiv: Noen fluer sender signaler til andre om behovet for å bevege seg bort fra kilden til karbondioksid. Insekter overfører samtalen for å rømme ved å berøre hverandre. Dessuten i fluer,mottar et signal, aktiveres mekanosensoriske nevroner i spissen av bena. For å bevise dette ble flere metoder brukt, inkludert optogenetikk. Spesielt i et av eksperimentene ble mekanosensoriske nevroner i spissene til potene med ChR2 innebygd i celler optogenetisk aktivert i fluer i en atmosfære med et normalt (ikke overdreven for dem) CO2-innhold, og insektene demonstrerte en unngåelsesrespons, som om det var en sterk lukt av karbondioksid ved siden av. gass.og insektene viste en unngåelsesrespons, som om det var en sterk lukt av karbondioksid rundt dem.og insektene viste en unngåelsesrespons, som om det var en sterk lukt av karbondioksid rundt dem.
Blant annet ved hjelp av fotoaktivering kan informasjon introduseres i nevroner som de ikke fikk i virkeligheten. Enkelt sagt, optogenetikk lar deg lage falske minner. Dette ble bevist av Susumu Tonegawa-teamet fra MIT i 2013, ved å bruke mus som eksempel (Science, 2013, 341, 6144, 387–391, doi: 10.1126 / science.1239073). Forskerne injiserte kanalrodopsin-2 i nevronene i to regioner i hippocampus som var ansvarlig for å oversette informasjon fra korttidsminne til langtidsminne - dentate gyrus og CA1-feltet. Bare de cellene ble merket med chanelrodopsin, som i foreløpige eksperimenter med registrering av elektrisk aktivitet, var begeistret hvis dyret ble skremt av lyd og elektrisk støt i visse "dekorasjoner" (de sier også - i en viss sammenheng). Det vil si, innledningsvis husket dyretat det er verdt å være redd for lyd i en setting, men ikke nødvendigvis i en annen. Etter det ble nevronene med channeledopsin spesialaktivert når dyret befant seg i annet "landskap", og i teorien skal ikke ha vist frykt. Under denne prosedyren frøs imidlertid mus i et nytt miljø (hvor de aldri ble elektrokuterte) på plass, gjemte seg i et hjørne eller skrek.
Siden det viste seg å bli introdusert i hodet som dyret aldri husket, er det definitivt mulig å returnere den tapte informasjonen. Dette ble gjort av ansatte ved samme laboratorium to år senere (Science, 2015, 348, 6238, 1007-1013, doi: 10.1126 / science.aaa5542). Først lærte de gnagerne en viss ferdighet, deretter sprøytet de dem inn i hjernen med proteinsyntesehemmere som forhindrer dem i å huske nylig lærte (dette har blitt bevist i mange tidligere arbeider). Imidlertid kan det glemte minnet hentes tilbake ved å optogenetisk aktivere visse celler i hippocampus. Vi fant ut hvilke nevroner som må aktiveres på omtrent samme måte som i forrige arbeid.
Optogenetikk og søvn
Optogenetikk har også hjulpet i studien av søvn. Det var kjent at i de laterale regionene av hypothalamus er det nevroner som skiller ut stoffet orexin, også kjent som hypocretin. Stabil våkenhet er umulig med et redusert innhold av hypocretin i hypothalamus. Hvis cellene som utskiller det ikke er aktive nok, utvikler dyret (og personen også) narkolepsi - under våkenhet forekommer plutselige søvnangrep. Pasienten sovner helt, eller så viser han noen individuelle tegn på søvn, for eksempel et kraftig fall i muskeltonus eller bevissthetstap. Narkoleptiske anfall kan ikke kontrolleres og kan skje i det mest inopportune øyeblikk - si når en person kjører.
Men det kan også være en tilfeldighet, og uten ytterligere eksperimenter kunne det ikke hevdes at det er orexin-nevroner som støtter våkenhet. Det var nødvendig å sjekke hva som skjer med søvn under aktiveringen. Forskere ved Karl Deisseroths laboratorium satte chanelrodopsin-2 inn i hypocretin-nevronene i hypothalamus fra mus, og stimulerte deretter periodisk gnagernes hjerner med lys mens de sov (Nature, 2007, 450, 420-424, doi: 10.1038 / nature06310). Mus ble vekket av denne effekten både i stadiet med langsom bølgesøvn og på stadiet med hurtigbølgesøvn. Samtidig ble orexin-nevroner aktivert med forskjellige styrker, avhengig av hvor ofte de ble skinnet. Alt dette samlet gir rett til å hevde at frigjøring av orexin (hypocretin) i tilstrekkelige mengder virkelig sikrer opprettholdelse av våkenhet.
Optogenetikk og hjertet
Optogenetikk trenger ikke bare brukes på nevroner, det er egnet for alle celler som kan bli begeistret av elektriske signaler. I tillegg til nevroner er dette i dyr muskelceller, inkludert hjertemuskelen. Kardiomyocytter må eksiteres synkront, dette sikrer samtidig sammentrekning. Eksperimenter med den optogenetiske aktiveringen av hjertecellene til rotteunger, mennesker og hunder har vist at eksitasjons- og sammentrekningsbølgene forårsaket av stimulering med blått lys ikke skiller seg i sine parametere fra de "ekte" elektriske bølgene (Circulation. Arrhythmia and elektrofysiologi, 2011, 4, 5, 753 –760, doi: 10.1161 / CIRCEP.111.964247, Heart Rhythm, 2012, 9, 11, 1910). Disse arbeidene ble ikke utført på levende gjenstander, men resultatene viser at aktiviteten til et syke hjerte teoretisk kan korrigeres ved bruk av optogenetikk.
Optogenetikk og psykiatri
Det vil sannsynligvis ikke være en overdrivelse å si at anvendelsen av metoden for optogenetikk i psykiatri er et av de viktigste sluttmålene til Deisseroth, gitt hans andre yrke. Det ville være flott å først lære hvordan nevroner i hjernen er koblet til hverandre, og så stimulere (eller undertrykke) overføring av signaler mellom de ønskede cellegruppene. Oppgaven er ekstremt tidkrevende, men teoretisk gjennomførbar. Utviklerne av optogenetikkmetoden har gjort flere funn på dette området. Noen av dem involverer dopaminsekreterende celler. Denne nevrotransmitteren spiller blant annet en enorm rolle i å opprettholde godt humør og gir en følelse av belønning for det du gjør (det sies at dopaminsekreterende nevroner er en del av belønningssystemet). Legemidler som kokain etterligner virkningen av dopamin på nevroner,forårsaker en følelse av tilfredshet. Kroppen husker denne sensasjonen og blir vant til stoffet, det dannes psykologisk og fysiologisk avhengighet.
Kjernen accumbens er en del av hjernens belønningssystem. Hvis dens dopaminsekreterende celler blir levert med halorhodopsin og deretter stimulert med lys, blir nucleus accumbens "slått av", og samtidig forsvinner de tidligere utviklede sug av eksperimentelle rotter for kokain midlertidig (Nature, 2014, 505, 309-317, doi: 10.1038 / nature12982). Det ville være mulig å gjøre lignende manipulasjoner på narkomane, men for dette vil det være nødvendig å endre genomet til nevronene deres, som ennå ikke har lov til.
Tilstrekkelig dopamin beskytter mot noen former for depresjon samt Parkinsons sykdom. Og hvis bidraget fra optogenetikk til studiet av parkinsonisme fremdeles ikke er veldig stort, så er gnagernes depressive oppførsel vellykket forsøkt eliminert ved bruk av fotoaktiverte kanaler (Nature, 2013, 493, 7433, 537-541, doi: 10.1038 / nature11740).
Så i teorien kan optogenetikk kaste lys over eventuelle patologiske tilstander assosiert med eksiterbare celler. Dette er ikke bare medikamentavhengighet og narkolepsi, depresjon og Parkinsons sykdom, men også schizofreni, hjerteinfarkt, angst, stresslidelser og mye mer. Så langt er muligheten til å behandle disse forholdene med fotoaktiverte kanaler et spørsmål om teknologi og moral. Imidlertid er det mulig at om 20–30 år vil potensialet til optogenetikk bare være begrenset av etiske prinsipper fra forskere og tjenestemenn som kontrollerer vitenskapelig forskning.
Svetlana Yastrebova
