Genteknikk åpner muligheter for menneskeheten til å skape organismer som ikke eksisterer tidligere og ødelegge genetiske sykdommer. Ting er imidlertid ikke så rosenrødt, til og med den banebrytende CRISPR / Cas9-teknologien er langt fra perfekt. Feilene hun gjør kan være sjeldne, men en er nok til å bli dødelig for en person. Lenta.ru snakker om hva som er galt med CRISPR og hvordan forskere prøver å fikse situasjonen.
CRISPR / Cas9-systemet - en slags DNA-saks - betraktes med rette som en revolusjon innen genteknikk. Med sin hjelp kan forskere redigere det menneskelige genomet, fjerne skadelige mutasjoner fra det, og dermed behandle ubehagelige og dødelige arvelige sykdommer. Man skal imidlertid ikke tro at det ikke var noen slike metoder før. I arsenalet av genetikere var for eksempel nukleaser som inneholdt sink "fingre", og endonukleaser - enzymer som bryter DNA-molekyler på bestemte steder. Når det gjelder nøyaktighet, allsidighet og pris, er de merkbart dårligere enn CRISPR / Cas9, selv om sistnevnte langt fra er perfekt.
CRISPR / Cas9 ble opprinnelig ikke opprettet av forskere, men av naturen. Det er en molekylær mekanisme som finnes i bakterier og lar dem bekjempe bakteriofager og andre parasitter. Faktisk fungerer det som en immunitet mot infeksjon. CRISPR (står for "korte palindromiske repetisjoner, regelmessig fordelt i grupper") er spesielle regioner (loci) av DNA. De inneholder korte fragmenter av DNA-virus som en gang smittet forfedrene til dagens bakterier, men ble beseiret av deres indre forsvar. Disse brikkene kalles avstandsstykker, og skilles fra hverandre ved å gjenta sekvenser.
Når en bakteriofag invaderer en bakterie, brukes hver repeterende sekvens og tilstøtende avstandsstykke som en mal for syntesen av molekyler kalt crRNA. Mange forskjellige RNA-kjeder dannes, de binder seg til Cas9-proteinet, hvis oppgave er ekstremt enkel: å kutte viruset til DNA. Imidlertid vil han være i stand til å gjøre dette bare etter at crRNA finner et komplementært fragment av viralt DNA. Etter at Cas9 har ødelagt den fremmede nukleinsyren, blir den sistnevnte ødelagt av andre nukleaser.
CRISPR / Cas9 er bra nøyaktig for sin nøyaktighet, fordi riktig funksjon av immunforsvaret for bakterier er et spørsmål om liv og død. "Anti-virus" -systemet trenger å finne en del av viralt DNA blant en million andre og, viktigst, ikke å forveksle det med sitt eget genom. I løpet av millioner av år med evolusjon har bakterier perfeksjonert denne mekanismen. Så rett etter at de fant ut hvorfor et CRISPR-system var nødvendig, skjønte de at det kunne tømmes som et enestående nøyaktig genredigeringsverktøy.
For å erstatte en bestemt region i genomet med en annen, er det nødvendig å syntetisere guide-RNA, som i prinsippet ligner på crRNA. Hun forteller Cas9 hvor det er nødvendig å gjøre et dobbeltstrengsbrudd i DNA til den modifiserte organismen. Imidlertid trenger vi ikke å ødelegge genet, men modifisere det - for eksempel erstatte en eller flere nukleotider og fjerne den skadelige mutasjonen. Her kommer naturen til unnsetning igjen. Naturlige reparasjonsmekanismer begynner umiddelbart å gjenopprette kuttkjeden. Trikset er at for å gjøre dette fjernes noen RNA-fragmenter nær pausen, hvoretter lignende sekvenser settes inn der. Forskere kan erstatte dem med sine egne DNA-sekvenser og dermed endre genomet.
Skjematisk fremstilling av CRISPR
Kampanjevideo:
Bilde: Kaidor / Wikipedia
Ingenting er imidlertid perfekt. Til tross for den relative nøyaktigheten gjør CRISPR-systemer noen ganger feil. En av grunnene ligger i selve systemet. Det er ulempe for bakterier at crRNA sammenfaller 100 prosent med et fragment av viralt DNA, som kan avvike med ett eller to nukleotider. Det er bedre for henne at noen nukleotider kan være forskjellige, noe som gir mikroorganismen en bedre sjanse for å bekjempe infeksjonen. Samtidig truer lav spesifisitet innen genteknologi feil: endringer kan gjøres på feil sted. Hvis dette skjer i løpet av eksperimenter på mus, vil det ikke være noen spesiell tragedie, men redigering av det menneskelige genomet kan bli en katastrofe.
Dette forklarer bekymringen fra vestlige forskere om eksperimentene som utføres i Kina. Asiatiske forskere har brukt CRISPR-teknologi for å genetisk modifisere menneskelige embryoer. Slike eksperimenter er forbudt i Europa og USA, men nylig har Storbritannia tillatt det - kun for forskningsformål. Slike embryoer må ødelegges i løpet av et par uker etter mottak, noe som ekskluderer "avl" av GM-mennesker.
Imidlertid ville ikke CRISPR / Cas9 være så bra hvis det ikke kunne forbedres. Så lærte forskere Cas9 å kutte ikke to kjeder samtidig, men bare en. Kuttet er laget på to forskjellige steder i DNA-sekvensen på forskjellige tråder, så systemet må kunne gjenkjenne dobbelt så mange nukleotider som normalt, noe som gjør det mer nøyaktig.
Protein Cas og crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Forskere ved University of Western Ontario har funnet en annen måte å forbedre denne teknologien på. De prøvde å løse problemet med å reparere det kutte DNA. Den raske restaureringen av nukleinsyrekjeden fører til at forskere ikke har tid til å gjøre sine egne korreksjoner i genomet. Dermed opprettes en ond sirkel: kjeden, reparert på en uønsket måte, må kuttes på nytt med Cas9-proteinet.
For å forhindre at dette skjer, modifiserte forskerne proteinsaksene for å lage TevCas9-proteinet. Det kutter DNA-strengen to steder, noe som gjør det vanskelig å reparere stedet. For syntesen av et nytt enzym ble enzymet I-Tevl tilsatt til Cas 9, som også er en endonuklease, det vil si et protein som spalter et DNA-molekyl i midten, i stedet for å spalte av endene av sekvensen, slik eksonukleaser gjør. Det resulterende fusjonsproteinet viste seg å være mer nøyaktig i binding til spesifikke steder og mindre sannsynlig å gjøre en feil og kutte feil sted.
Krystallstruktur av Cas9 bundet til DNA
Foto: Cas9 wiki-prosjekt / Wikipedia
Det er en annen måte å forbedre nøyaktigheten til CRISPR-systemer. "Våpenkappløpet" mellom bakterier og virus har ikke bare ført til utviklingen av forsvarssystemer i mikroorganismer, men også til måter å nøytralisere dem på. Dermed muterer bakteriofager raskt og mister områdene som bakteriell immunitet gjenkjenner dem. Imidlertid noe kode for anti-CRISPR proteiner, som forstyrrer arbeidet til crRNA-Cas9-komplekset.
8. desember publiserte tidsskriftet Cell en artikkel av forskere fra University of Toronto som opprettet "anti-CRISPR" - et system som lar deg slå av mekanismen under visse forhold. Det forhindrer uønskede feil ved å undertrykke Cas9-aktivitet i tilfelle at guide-RNA binder til feil fragment. Anti-CRISPR består av tre proteiner som hemmer nuklease og blir kodet av genene til et av bakterievirusene.
CRISPR-teknologi brukes allerede til å behandle alvorlige sykdommer som leukemi og lungekreft, og blir også testet for å fjerne HIV fra immunceller. Etter hvert som forskere finner nye måter å forbedre denne metoden på, vil flere og flere muligheter for anvendelsen åpne seg.
Alexander Enikeev
