Forskere har store forhåpninger for CRISPR / Cas9-teknologien, som tillater endringer med høy presisjon i genomene til levende organismer, inkludert mennesker. Alle nye vitenskapelige artikler blir publisert som beskriver forskjellige typer CRISPR-systemer, samt endringer. "Lenta.ru" snakker om funnene i dette området, gjort i 2016.
Tusenvis av dem
CRISPR / Cas9 er et bakterielt adaptivt immunitetssystem som gjør at mikroorganismer kan bekjempe virus. Den består av avstandsstykker - DNA-seksjoner som tilsvarer visse fragmenter (protospacers) av smittestoffets DNA. Avstandsstykker koder for spesifikke crRNA-molekyler som binder seg til Cas9-enzymet. Det resulterende komplekset fester seg til virusets DNA-kjede, og Cas9 fungerer som en saks og klipper den.
Faktisk er CRISPR / Cas9 bare ett av mange lignende systemer som bakterier og arkea har. Forskere deler dem i to klasser. Den første klassen inkluderer CRISPR-systemer av type I, III og IV, og den andre - II og V. Type II inneholder Cas9-proteinet som er involvert i anskaffelse av nye avstandsstykker, akkumulering av crRNA i cellen og DNA-spaltning. I andre systemer brukes multiproteinkomplekser til disse formålene. Dette gjør type II til den enkleste typen CRISPR-system som er egnet for gentekniske behov.
Typer kan i sin tur deles inn i undertyper, avhengig av hvilke ekstra gener som er assosiert med CRISPR. For eksempel inneholder IIA-systemer csn2-genet, som koder for et protein som binder seg til DNA og er involvert i anskaffelsen av avstandsstykker. I IIB-systemer er csn2 fraværende, men det er et cas4-gen, hvis funksjon fortsatt er ukjent, og IIC-systemer har verken csn2 eller cas4.
Skatter inne i bakterier
Kampanjevideo:
Alle kjente CRISPR-systemer er blitt oppdaget av forskere i bakterier dyrket under laboratorieforhold. Imidlertid er det et stort antall ukultiverte mikroorganismer, som inkluderer både archaea og bakterier. De lever vanligvis under ekstreme forhold - mineralkilder eller giftige vannmasser i forlatte gruver. Imidlertid kan forskere isolere DNA fra dem og identifisere spesifikke regioner i det. I et nytt papir publisert i Nature 22. desember dekodet genetikere ved University of California, Berkeley genomer fra naturlige mikrobielle samfunn, og oppdaget andre variasjoner av CRISPR-systemet.
Bakteriofag - et virus som infiserer bakterier
Bilde: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Forskere klarte å finne ut at noen typer lite studerte arke-lignende nanoorganismer ARMAN også har CRISPR / Cas9, selv om man tidligere trodde at bare bakterier har dem. Det bemerkes at dette systemet opptar et mellomliggende sted mellom undertypene IIC og IIB og kan tjene som et forsvar mot parasittiske "hoppende" gener (transposoner) som kommer inn i mikroorganismen fra andre archaea. Et forsøk på å reprodusere aktiviteten til archaeal CRISPR / Cas9 i E. coli (Escherichia coli) førte ikke til noe, noe som indikerer eksistensen av noen ytterligere spesifikke mekanismer som regulerer systemet.
Nye typer systemer i andre klasse, CRISPR / CasX og CRISPR / CasY, ble også identifisert fra bakterier som lever i grunnvann og sedimenter. CRISPR / CasX-systemet inkluderer proteiner Cas1, Cas2, Cas4 og CasX. Sistnevnte, som vist ved eksperimenter på E. coli, er preget av nukleaseaktivitet, det vil si at den er i stand til å spalte fremmed DNA som Cas9. Dette skjer imidlertid bare hvis TTCN-sekvensen er foran protospacers, hvor N er noen av de fire nukleotidene. Slike sekvenser kalles PAM (protospacer tilstøtende motiv - motiv ved siden av protospacer). CRISPR / Cas9-systemet har også sin egen PAM - NGG, som skal være plassert etter protospaceren. I tillegg er CRISPR / CasY i stand til å kutte DNA hvis det er en TA PAM-sekvens nær målstedet.
Hva er løftet om denne oppdagelsen? Faktum er at de oppdagede systemene er de mest kompakte som er kjent for øyeblikket. Ifølge forskere gjør den lille mengden proteiner som kreves for arbeidet deres CRISPR / CasX og CRISPR / CasY praktiske verktøy for DNA-redigering. Videre vil metagenomiske studier, hvor DNA som er oppnådd fra miljøet studeres, avsløre andre typer CRISPR-systemer som er nyttige for genteknikk.
Veien til fortreffelighet
Selvfølgelig er det et alternativ til søket etter CRISPR-systemer i naturen - forbedring av den allerede eksisterende CRISPR / Cas9-teknologien. Til tross for sin høye nøyaktighet gjør hun feil ved å kutte DNA på feil sted. Dette gjør det vanskelig å gjøre de riktige endringene i gener og derfor effektivt behandle arvelige sykdommer. Derfor leter forskere etter måter å forbedre ytelsen til systemet. I 2016 har det vært mange vitenskapelige artikler viet til å modifisere CRISPR og gjøre det om til forskjellige genverktøy.
Protein Cas9 og crRNA - hovedkomponentene i CRISPR-systemet
Bilde: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Så 8. desember publiserte tidsskriftet Cell en artikkel av forskere fra University of Toronto, som opprettet "anti-CRISPR" - et system som slår av mekanismen under visse forhold. Dette lar deg undertrykke Cas9-aktivitet hvis guide-RNA binder til feil fragment og forhindrer feil. Anti-CRISPR er sammensatt av tre nukleasehemmende proteiner. Naturligvis ble det først ikke oppfunnet av forskere, men av virus, som dermed nøytraliserte immuniteten til bakterier.
I juni bekreftet amerikanske forskere, sammen med kollegaer fra Russland, at CRISPR / C2c2-systemet, hentet fra fusobacterium Leptotrichia shahii, er i stand til å kutte enkeltstrenget RNA. Som et resultat kan CRISPR-systemet brukes til å slå ut - undertrykke funksjoner - av messenger RNA, som bærer informasjon fra gener til ribosomer, hvor proteiner blir syntetisert på grunnlag.
I mai opprettet forskere ved University of California CRISPR-EZ-teknologien, som gjør at nye DNA-molekyler kan settes inn i genomene til musembryoer med nesten hundre prosent suksess. CRISPR / Cas9-systemet introduseres i befruktede dyreegg ved hjelp av en mikroskopisk nål og en liten elektrisk utladning. I eksperimentet klarte forskere å introdusere en mutasjon i et gen hos 88 prosent av musene. Dette overstiger antall genetisk modifiserte mus produsert ved CRISPR-redigering, som bruker konvensjonelle injeksjoner.
I april, ved å bruke en mutant variant av Cas9 som mangler nukleaseaktivitet, utviklet molekylærbiologer ved University of Massachusetts School of Medicine CRISPRainbow-teknologien. Veilednings-RNA, som indikerer hvor enzymene binder, inneholdt fluorescerende merker, som for eksempel gjør det mulig å spore bevegelsen av mobile genetiske elementer.
Anopheles-mygg kan være det første offeret for CRISPR-systemer
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Vidunderlige nye verden
Forskere bruker allerede CRISPR-systemer for å lage genetisk modifiserte organismer, som malariamygg, som sprer skadelige gener blant sine ville slektninger. Denne metoden kalles gendrift. Hvis en av foreldrene til et individ var bærer av et mutantgen, vil han gi det videre til sine avkom med 50 prosent sannsynlighet. Dette er fordi foreldrene har to kopier av genet, og bare en av dem er defekt. CRISPR er i stand til å kopiere et mutantfragment og sette det inn i et sunt gen. Som et resultat får avkommet en mutasjon med 100% sannsynlighet.
I 2016 godkjente eksperter fra Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) en søknad fra University of Pennsylvania om å utføre tester på human genetisk modifisering ved bruk av CRISPR / Cas9-teknologi.
Imidlertid ble de forbigått av kineserne. I november rapporterte tidsskriftet Nature at kinesiske forskere for første gang introduserte celler med gener modifisert av CRISPR / Cas9-systemet til mennesker. Forskerne ekstraherte immunceller (T-lymfocytter) fra blodet til en pasient med metastatisk lungekreft, og brukte deretter CRISPR-teknologi for å slå av genet som koder for PD-1-proteinet. Sistnevnte har vist seg å undertrykke immunitet ved å fremme tumorvekst. Forskere dyrket de redigerte cellene, økte antallet og injiserte dem deretter tilbake i menneskekroppen. Om genterapi vil takle sykdommen gjenstår å se.
CRISPR-systemer kan også brukes til å bekjempe hiv og arvelige sykdommer hos mennesker. Imidlertid er det nødvendig med videre forskning for å utvikle effektive behandlinger. Selvfølgelig snakker vi ikke om mutanter, som i science fiction-filmer, men forskere vil raskt kunne lage genetisk modifiserte organismer, for eksempel landbruksplanter med motstand mot parasitter. Det gjenstår å se hvorfor forskerne som oppdaget CRISPR og fant ut hvordan den kunne brukes, ennå ikke har mottatt Nobelprisen.
Alexander Enikeev
